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脂肪组织冰冻切片快速制片方法详解

2026-04-14 09:34

脂肪组织冰冻切片快速制片方法详解

一、引言

在医学研究和临床诊断中，病理切片是一种非常重要的诊断手段。而脂肪组织的冰冻切片制作，对于脂肪相关疾病的研究和诊断具有关键意义。与传统的石蜡切片相比，冰冻切片能够在短时间内完成制片，满足术中快速病理诊断的需求。然而，脂肪组织中存在脂肪滴，其很难被脱水剂溶解，石蜡也不能将其完全浸透，这给切片制作带来了一定的挑战。因此，掌握脂肪组织冰冻切片快速制片方法至关重要。

二、脂肪组织冰冻切片的概述

2.1 定义与原理

冰冻切片，又称冷冻切片，是一种通过快速冷冻组织样本并在低温条件下切片的技术。其原理是使用液氮或低温冷冻剂（如OCT化合物）使组织在短时间内凝固，减少冰晶形成，避免细胞结构破坏。然后在恒冷切片机（通常设定在 -20℃至 -30℃）中切割组织，保持样本硬度，确保切片完整。

2.2 适用场景

冰冻切片适用于术中快速病理诊断，如肿瘤良恶性判断、手术切缘评估、淋巴结转移检测等。同时，在科研与教学领域也有广泛应用，例如免疫组化（IHC）、分子生物学研究（如荧光原位杂交（FISH）、PCR等需新鲜组织的研究）。

三、脂肪组织冰冻切片快速制片的前期准备

3.1 取材要点

在合适的环境下获取脂肪组织，一般大小为 1.5×1.5×0.5cm。注意应尽量剔除脂肪组织、钙化、骨质等影响切片质量的成分。在对脂肪组织进行病灶取材的时候要取薄一些，因为脂肪组织中存在脂肪滴，其很难被脱水剂溶解，石蜡不能将其完全浸透，取薄一些更有利于后续的切片制作。

3.2 仪器与试剂准备

需要准备德国Leica CM 1950型恒低温冷冻切片机等专业设备，以及液氮、OCT包埋剂、苏木精染液、伊红染液、冰冻固定液、封片剂等试剂。同时，要确保切片机的刀片锋利，定期校准和维护冰冻切片机，保证其性能稳定。

四、脂肪组织冰冻切片的快速制片步骤

4.1 速冻

速冻方法有液氮法和干冰 - 丙酮（乙醇）法。液氮法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内，然后将其放入盛有液氮的小杯内，注意小盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，10 - 20s组织即迅速冰结成块。干冰 - 丙酮（乙醇）法是将 150 - 200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达 -70℃，然后使用异戊烷进行速冻。

4.2 切片

将速冻后的组织块固定在切片机上，调整切片的厚度为 4 - 6μm。切片时保持匀速、稳定的动作，避免产生褶皱和裂痕。可以使用锋利的刀片和防卷板，防止切片卷曲。若使用德国Leica CM 1950型恒低温冷冻切片机，可先控制冷冻头 -35℃，用新的锋利刀片，首先调整切片厚度为 5μm 进行冰冻切片制作数张，后将切片厚度调整至 15μm 甚至更厚。

4.3 贴片

将切好的组织切片立即放入冰冻固定液中固定 10 - 20 秒，然后取出贴片。裱片温度应在 42 摄氏度以下，捞片速度要快，以保证切片的质量。

4.4 染色

使用苏木精染液进行染色，室温下染色 1 分钟，如果室温较低，则需要适当延长染色时间。然后进行水洗，洗去多余的染液。之后再用伊红染液染细胞质（粉红色），使细胞核和细胞质清晰可见，便于病理医生观察。

4.5 封片

将切片晾干后，使用合适的封片剂进行封片。滴加树脂封固剂，盖上盖玻片，完成制片过程。

五、提高脂肪组织冰冻切片质量的技巧

5.1 优化取材与处理

确保取材大小适中，厚度一般不超过 3 - 4 毫米，避免组织过大或过厚影响切片质量。在切片前，可将组织适当吸干水分，减少冰晶形成。同时，在修到最大面时，应用冰块冰冻蜡块几秒，温度低可以凝固未脱透的脂肪滴，然后再进行切片处理。

5.2 温度控制

适当降低冰冻温度，一般在 -20 至 -30℃，有助于获得更好的切片效果。在切片过程中，要保持组织的冷冻状态，防止组织内的冰晶形成和细胞结构的破坏。

5.3 切片技术优化

使用锋利的刀片，切片时保持匀速、稳定的动作，避免产生褶皱和裂痕。合理使用防卷板，防止切片卷曲。若切片厚度为 2 - 3μm 时，容易出现碎裂的情况，在进行展片的时候褶皱很难打开，会有不平整、裂纹等情况存在，此时蜡块不应该进行长时间的冷冻，在修到最大面的时候应该先用沾有温水的拇指对蜡块捂几秒钟，再冰冻几秒，然后快速完成切片过程，这样可以有效避免上述情况的发生，形成一个完整的切片。