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实现冰冻切片无冰晶的方法与要点

2026-04-14 09:33

如何实现冰冻切片无冰晶

一、冰冻切片概述

冰冻切片，又称冷冻切片，是一种通过快速冷冻组织样本并在低温条件下切片的技术。与传统的石蜡切片需要数天不同，冰冻切片能在10 - 20分钟内完成制片，适用于术中快速病理诊断。它在科研与教学方面也有广泛应用，例如免疫组化（IHC），某些抗原在石蜡切片中可能被破坏，而冰冻切片能更好保留蛋白质结构；还可用于分子生物学研究，如荧光原位杂交（FISH）、PCR等需新鲜组织的研究。不过，冰冻切片也存在一些局限性，组织形态略差，冰晶可能造成细胞空泡化，影响细节观察；不易长期保存，通常仅短期保存；技术要求高，切片厚度、染色质量依赖操作者经验。

二、冰晶形成的原因及危害

（一）形成原因

在冰冻切片过程中，冰晶形成的主要原因与组织内的水分有关。当组织缓慢冷却时，组织内的水分子逐渐聚集形成冰晶。含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份渗入到组织中，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。此外，组织在 -4℃ 左右的低温环境中停留时间越长，组织内所产生的冰晶的体积越大、数量越多，即组织内形成冰晶的数量与组织冷冻的速度成反比。

（二）危害

冰晶一旦形成，它们就逐渐膨胀，并挤压围绕它们的细胞器。当冰冻的组织切片在室温晾置时，由于温度高，使冰晶融化，在组织上留下许多孔状的空隙，导致结构的破坏甚至于酶和蛋白等微细结构的移位，以致于影响实验结果的准确性，还会影响抗原定位，使得切片的质量下降，不利于后续的观察和研究。

三、冰冻切片的操作流程及易产生冰晶的环节

（一）操作流程

样本取材：外科医生将新鲜组织送至病理科，病理技师选取最具代表性的部位（如肿瘤边缘或可疑病变区），避免坏死或出血区域。
组织冷冻：有直接冷冻法，小样本可直接放入恒冷切片机的冷冻台；OCT包埋法，较大或易碎的组织需用OCT（Optimal Cutting Temperature）胶包埋，以提供支撑；液氮速冻，某些特殊研究（如酶活性检测）需用液氮（ -196℃）急速冷冻，减少冰晶损伤。
切片：将冷冻的组织块固定在切片机上，调整厚度（通常4 - 10微米），用防卷板平整切出薄片，贴附于玻片。
固定与染色：切片经甲醇或乙醇固定后，进行快速HE染色，苏木精（Hematoxylin）染细胞核（蓝色），伊红（Eosin）染细胞质（粉红色）。
封片与阅片：滴加树脂封固剂，盖上盖玻片，由病理医生在显微镜下诊断。

（二）易产生冰晶的环节

在组织冷冻环节，如果冷冻速度过慢，就容易产生冰晶。例如使用恒冷箱切片机进行冷冻时，若没有采取有效的快速冷冻措施，组织内的水分就会逐渐形成冰晶。另外，在取材后若使用了含水的固定液且组织未完全固定，也会增加冰晶形成的可能性。

四、实现冰冻切片无冰晶的方法

（一）单纯OCT胶包埋法

将新鲜组织迅速置于包埋托上，再将组织的表面全部用进口OCT胶包后放入低温切片机内冷冻5分钟左右切片。OCT胶即最佳切片温度溶液，是一种多糖物质，它既可以起到包埋支架的作用，又可以置换组织内的水分来减少冰晶的形成，但它的置换效果远不及高张蔗糖明显。不过这种方法镜下观察会见较大、较多的冰晶形成，冰晶形成面积明显高于低温骤冷法及高渗透压脱水法，严重影响观察结果的准确性。

（二）高渗透压脱水法

将新鲜取材的组织迅速置于20% - 30%的蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，待组织块沉底后，取出，PBS冲洗后用OCT胶包埋切片。高张蔗糖能以其较高的表面张力置换组织内的水分以减少冰晶的产生，但蔗糖的黏滞性常使切片粘于刀上，难以取下，若辅以OCT胶包埋则可以切出很完整的切片。这种方法有较少、较小的冰晶形成，冰晶形成面积高于低温骤冷法。

（三）低温骤冷法

将组织块置入低温环境中，使组织骤然降温。常用的是液氮骤冷，即将新鲜取材的组织迅速置于液氮罐内10 - 30秒，取出，OCT胶包埋后置于低温切片机内待其复温至 -20℃左右即可切片。液氮能在几秒钟内将组织降至 -195℃的超低温，最大限度地减少了冰晶的形成。但液氮因其超低温的冷冻常使较大的组织冻裂，若将组织用OCT胶包埋后再置于液氮内，OCT胶在低温下固化，形成一固态的外壳防止组织断裂，保证了结构的完整性。液氮骤冷法几乎无冰晶形成，是最佳的防冰晶方法。

五、操作过程中的注意事项

（一）包埋

包埋时要尽量防止气泡产生，包埋时存在气泡会造成包埋不均匀，在切片时因气泡与OCT胶质地不同，所切的片子容易从气泡周围开始卷曲。包埋后须把OCT胶修成长方形、正方形或是梯形，保证所切的脑片周边没有小的尖刺，切片周边小的尖刺或切片形状不规则都容易使切片从这些不规则的地方开始卷曲。

（二）固定样品托与切片

牢固固定样品托，虽然现在冰冻切片机结构良好，但是这个问题容易被操作者忽视。若样品托固定不牢固或有转动的情况，由于组织重力和刀片的相互作用会使切片成弧形而造成贴片不完全。切片时要先慢后快，先慢为使刀片切力小，使组织片不容易卷曲，后快为使所切的组织片远离刀片边缘，使得贴片容易。组织标本最好一次性切完，因组织抗原通常是一种蛋白质，反复冻溶组织会损伤组织抗原；而且被反复冻融的组织会变脆甚至性状发生改变，从而使切片和贴片困难，使组织更易出现脱片情况。

（三）贴片

可在载玻片上滴3μl左右的PBS后贴片，以所滴的PBS为起点轻轻沾起组织片，该过程要防止气泡产生。

（四）储存

贴片完成后，需室温待载玻片上的PBS晾干后，将切片放入 -80℃冰箱中备用，否则残留的PBS会在玻片与脑片间结冰，导致免疫组化过程中易出现脱片现象。刚刚切好的冰冻切片不宜马上作免疫组化，容易出现脱片，可能是因为明胶这种蛋白质与硫酸铬钾形成的胶状混合物涂在载玻片上后，再与富含脂肪的脑片黏合需要一定的时间。切片完成后放于 -80℃冰箱2至3天后，待脑片与玻片黏合充分后，再做免疫组化则不易出现脱片。切片放置时间不宜超过一个月，否则会影响冰冻切片上的抗原。