脂肪切片染色方法详解

一、脂肪染色的重要性和常用染料

在医学和生物学研究中，脂肪切片的染色是一项关键技术。它能够帮助我们观察和分析组织中的脂肪分布、含量以及形态变化，对于疾病的诊断、发病机制的研究等都具有重要意义。常用的脂肪染色染料有苏丹染料（如苏丹Ⅱ、苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ）、油红O等。这些染料都是脂溶性的，它们既能溶于有机溶剂如乙醇、丙酮内，又能溶于脂肪内。由于该类染料在脂质中溶解度较大，染色时染料便从染液中转移到被染的脂质中去，使脂质呈现染液的颜色。

二、苏丹Ⅳ染色法

试剂配制

甘油明胶的配制：先将明胶溶于蒸馏水，置于37℃的温箱或水浴箱中一晚使其完全溶解，期间可稍微摇动，然后加入甘油和苯酚结晶，再转入37℃的温箱30分钟，使彻底溶解并混匀即可用。该液于室温呈冻胶状，可保存使用1 - 2年，用前置于37℃的温箱或温水内待溶解后即可行冷冻切片的脂肪染色封盖。苏丹Ⅳ染液可将1 - 2克猩红染剂加纯酒精70ml，10%氢氧化钠20ml，蒸馏水10ml，制成混合液，以微火加热，置37℃温箱中1小时，取出冷却后过滤，12小时后即可使用。不过此液5天内失效，也可配制70%酒精饱和液，或纯丙酮和70%酒精饱和液，它们使用方便，且不易失效。

染色步骤

1. 新鲜组织低温恒冷切片，根据组织内所含脂肪的多少，切片温度可调解在 - 20℃～ - 25℃，若为脂肪瘤，宜调至 - 30℃。切片厚6～8um，裱贴于玻片。
2. 70%的乙醇稍浸洗。
3. 苏丹Ⅳ染液浸染1分钟。
4. 70%的乙醇洗去多余染液。
5. 蒸馏水浸洗1分钟。
6. Mayer苏木精染胞核2分钟。
7. 水洗10分钟，再用蒸馏水洗1次。
8. 用滤纸把组织周围水分抹干。
9. 甘油明胶封盖。

结果

中性脂肪呈红色（用苏丹Ⅳ染液），胞核呈蓝色。

注意事项

1. 如已经用10%的甲醛液固定的组织作脂肪染色，则不易用低温恒冷切片机切片，需采用半导体制冷切片，厚8～10um，置于一小缸蒸馏水内展开，用玻璃钩把切片捞入70%的乙醇内稍洗，跟着捞入苏丹Ⅳ染液染1分钟，再捞出移入70%的乙醇漂洗，后续按正常步骤操作，全过程用捞片染色，至最后用玻璃钩把切片捞在载玻片上，抹干周围水分，用甘油明胶封盖。
2. 用甘油明胶封盖的标本，保存时间不长。如需较长时间保持，可在盖玻片的四周与载玻片交界处用中性树胶作一堤围状封固，堤围宽度约2～3mm，但在滴甘油明胶时以不溢出盖玻片边缘为准。
3. 苏丹Ⅳ属偶氮类燃料，不溶于水，稍溶于脂溶剂，易溶于脂肪。它的分子结构比苏丹Ⅲ多两个甲基。可用苏丹Ⅱ或苏丹Ⅲ代替苏丹Ⅳ，染色结果分别呈橙黄色至橙红色或橙红色。
4. 苏丹类染料除用等份70%的乙醇和丙酮混合液外，也可用异丙醇、乙二醇或仅用70%的乙醇作为溶剂。用乙醇丙酮作为溶剂配制的染液溶解度大些，但也会溶脱微小滴状脂质。
5. 凡作脂肪染色的组织都不能采用含乙醇的固定液固定，而必须用甲醛液固定，不能作石蜡切片而须作冷冻切片或石蜡切片。
6. 配制苏丹染液的溶剂都是脂溶剂，有挥发性，配好后的染液一定要密封保存，用前才吸出小量置于有盖的小玻璃皿内进行染色，否则染液易发生沉淀，造成切片污染。
7. 用苏丹Ⅳ 0.3g，苏丹Ⅲ 0.2g溶于等份70%的乙醇和丙酮各50ml，用此染液染出的脂肪滴呈猩红色带橙红色，效果较好。

三、油红O染色法

试剂配制

1. 油红O贮备液：将油红O 0.5g和无水乙醇100ml倾入三角烧瓶内，轻轻摇动使其尽量溶解，过滤到小口砂塞瓶密封保存备用。
2. 油红O工作液：取油红O贮备液18ml，加蒸馏水12ml，充分混合后静置10分钟后使用。
3. 70%的乙醇。
4. Mayer苏木精。

染色步骤

1. 新鲜组织低温恒冷切片，切片温度和厚度要求与苏丹Ⅳ法类似。
2. 切片于70%的乙醇稍洗。
3. 油红O工作液浸染（加盖）5～10分钟。
4. 70%的乙醇稍洗去多余染液。
5. 蒸馏水稍洗。
6. Mayer苏木精浅染胞核2分钟。
7. 水洗10分钟，再用蒸馏水稍洗。
8. 用滤纸把组织周围水分抹干。
9. 甘油明胶封盖。

结果

中性脂肪呈深橙红色，胞核呈蓝色。

注意事项

1. 油红O又名苏丹红5B，为多偶氮染料，它比苏丹Ⅳ又多两个甲基，由于它所染的颜色较深，呈深橙红色，故为较好的中性脂肪染料。
2. 原法用异丙醇配制油红O，改用无水乙醇代替异丙醇更加简单。
3. 油红O工作液只能当天使用，用后不能保存。
4. 也可用Harris苏木精染核，但水洗后需用1%的盐酸乙醇分化，使脂滴和胞核清晰。
5. 其他可参考苏丹Ⅳ法的注意事项。对于细胞样品，处理结束后，PBS洗3次；加入10%多聚甲醛固定30min，PBS洗三次；油红O染色30min（避光），PBS洗三次，观察；加异丙醇，转移后定量。油红O工作液的配置是油红O储存液（300mg油红O粉末溶于100mL99%异丙醇中，室温保存并避光），按照油红O储存液与超纯水（3：2）稀释，滤膜过滤，现用现配，并注意避光。油红O溶液是饱和溶液，在室温放置一段时间或4℃保存时，可能会有少量沉淀析出，同时，为了避免异丙醇的挥发，需要现用现配。染液体积均匀覆盖到细胞即可，可以适当延长染色时间，但不宜超过60min。

四、苏丹Ⅲ染色法

试剂配制

1. 苏丹Ⅲ染液配法：将0.15克苏丹Ⅲ溶解于100ml70%酒精或纯丙酮和70%酒精混合液中（各50ml），临用时过滤，所得滤液即为饱和浓度。浸染时，容器必须盖好，否则酒精或丙酮挥发，染料沉淀。
2. 甘油明胶配制：明胶40g，蒸馏水210ml，甘油250ml，石碳酸结晶5ml。先将明胶浸入蒸馏水中2小时或更长时间，然后加甘油和石碳酸，加热15分钟，摇搅直至混合液均匀为止。

染色步骤

1. 固定于10%甲醛的组织。
2. 水洗后采用冰冻或石蜡切片。
3. 经蒸馏水后，浸染于Harris苏木素或明矾苏木素中淡染1 - 2分钟。
4. 自来水冲洗。
5. 水洗后，移入70%酒精5秒钟。
6. 投入苏丹Ⅲ染液中约30分钟或更长时间，置于56℃温箱中。
7. 在70%酒精中洗涤5 - 10秒钟。
8. 洗于蒸馏水中，然后将切片移于载玻片上。
9. 将切片周围的水分小心擦掉。
10. 甘油明胶封固。

结果

脂肪呈橙红色或鲜红色或黑色，胆脂素呈淡红色，脂肪酸不着色，细胞核呈蓝色。

五、高碘酸 - 无色品红法（PAS法）

试剂配制

1. 0.5%的高碘酸。
2. 1mol/L盐酸。
3. 无色品红液：碱性品红1g，蒸馏水200ml，1mol/L盐酸20ml，偏重亚硫酸钠1～1.5g，活性炭2g。配制方法为取一个500ml的洁净三角烧瓶盛蒸馏水200ml，在电炉上煮沸后，加入碱性品红，搅拌使其溶解，冷却至50℃左右，加入盐酸和偏重亚硫酸钠，继续搅拌，待溶液冷却至室温后，加入活性炭，搅拌1分钟，过滤，滤液即为无色品红液。

染色步骤（此处未详细提及，可进一步查阅资料完善）

结果（此处未详细提及，可进一步查阅资料完善）

注意事项（此处未详细提及，可进一步查阅资料完善）

六、锇酸染色法

锇酸染色法也是一种用于脂肪染色的方法。在相关研究中，取新鲜脂肪组织及肝组织，以锇酸浸染组织块后进行石蜡包埋切片及眦复染。结果显示切片脂肪滴呈黑色。锇酸染色和碳蜡包埋技术在脂肪染色中，具有冰冻切片和石蜡切片的优点，弥补了常规冰冻切片脂肪染色的缺点和局限性，在病理检验及科研中具有一定应用价值。不过该方法也有其自身的特点和注意事项，例如锇酸具有毒性，操作时需要严格遵守安全规范等。

综上所述，不同的脂肪切片染色方法各有优缺点和适用范围。在实际应用中，需要根据研究目的、组织类型、实验条件等因素选择合适的染色方法，以获得准确、清晰的染色结果，为医学和生物学研究提供有力的支持。