石蜡切片快速上手技巧

一、石蜡切片概述

石蜡切片是病理切片制作中常用的方法，在医学诊断等领域有着至关重要的作用。它就像一张“细胞的照片”，将人体或动物的病变组织经过特殊处理，切成极薄的切片，通过显微镜观察其微观结构，常用于癌症、炎症、感染等疾病的确诊，被誉为临床诊断的“金标准”之一。要快速上手石蜡切片技术，需要全面了解其各个步骤以及相关的注意事项。

二、前期准备工作

（一）材料准备

选取新鲜的组织样本是关键，一般将其切成适当大小，厚度不超过5mm，以保证固定液能充分渗透。常用的固定液是4%多聚甲醛，固定时间根据组织类型和大小而定，一般为6 - 24小时，目的是保持组织的形态和结构。此外，还需要准备各种浓度的乙醇、二甲苯、石蜡、苏木精 - 伊红染液、中性树胶等试剂，以及切片刀、切片机、温箱、温台、解剖刀、镊子等实验器材。

（二）设备调试

在开始操作前，要确保切片机等设备处于正常工作状态。检查切片机的切片微动部分是否灵活，齿轮是否正常，如有问题及时修理或调整。同时，将温箱温度设置到合适的范围，如浸蜡时温箱温度一般设置在56 - 60℃。

三、切片前处理步骤

（一）脱水与透明

把固定好的组织依次经过不同浓度的乙醇溶液进行脱水，一般从70%、80%、90%、95%到100%乙醇，每个梯度浸泡1 - 2小时，去除组织中的水分。组织经无水乙醇脱水后，放入二甲苯等透明剂中，使组织透明，便于石蜡渗透，浸泡时间约30分钟至1小时。在脱水和透明过程中，要严格按照梯度和时间进行操作，确保组织处理均匀。

（二）浸蜡与包埋

将透明后的组织放入融化的石蜡中，在56 - 60℃的温箱中进行浸蜡，一般经过2 - 3次，每次1 - 2小时，使石蜡充分而均匀地渗入组织内部。然后将浸蜡后的组织放入包埋模具中，倒入融化的石蜡，待石蜡冷却凝固后，组织就被包埋在石蜡块中。包埋时要注意避免过度冷却导致石蜡碎裂或组织变形。

四、切片操作技巧

（一）切片厚度控制

使用切片机将石蜡块切成厚度为3 - 5μm的薄片。切片厚度的控制非常关键，过厚可能会导致细胞重叠，影响观察效果；过薄则容易使切片破碎。在操作切片机时，要根据组织的性质和实验要求，缓慢、稳定地调整切片厚度。

（二）切片刀的使用

切片刀的锋利程度和角度对切片质量有很大影响。如果切片刀不够锋利，切片容易上卷且不能形成连续蜡带，此时需要重新磨刀。同时，要调整好切片刀与蜡块的角度，一般保持在合适的范围内，以保证切片的顺利进行。此外，切片刀各处的锋利程度应尽量一致，若不一致可能会导致切片弯曲且不能形成直带，这时可移动切片刀，更换刀口位置。

（三）展片与捞片

将切好的薄片漂浮在40℃温水中使其充分展平，这一步要注意水温的控制，水温过高可能会使切片变形，水温过低则切片不易展平。然后用载玻片将展平的切片捞起，放在60℃左右的烤片机上烤片1 - 2小时，使切片牢固地黏附在载玻片上。在捞片过程中，动作要轻柔，避免切片出现皱褶或断裂。

五、染色与封片要点

（一）脱蜡与水化

将烤好的切片依次放入二甲苯、不同浓度的乙醇中进行脱蜡和水化，使切片回到水相。脱蜡要彻底，依次使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行梯度脱蜡，每缸浸泡5分钟，任何残留的石蜡都将干扰抗原暴露及染色效果。复水采用梯度乙醇（100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇）依次脱水，每级作用5分钟，最后经纯化水浸洗5分钟完成水化过程。注意要避免干片，干片会导致非特异性抗体结合出现高背景。

（二）染色过程

常用苏木精 - 伊红（HE）染色，先经苏木精染液染色，水洗后用盐酸酒精分化，再经伊红染液染色。染色过程中要掌握好染色时间和染液浓度，染色时间过长或过短、染液浓度过高或过低都会影响染色效果。例如，苏木精染色时间过长，细胞核颜色会过深；伊红染色时间过短，细胞质颜色会过浅。

（三）封片操作

染色后的切片依次经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明，最后用中性树胶封片。封片时要注意避免产生气泡，可将盖玻片从一侧缓慢放下，使树胶均匀覆盖切片。长期保存建议用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封，以防止切片褪色和污染。

六、常见问题及解决办法

（一）切片上卷且不能形成连续蜡带

原因可能是切片刀不够锋利、切片刀与蜡块的角度不当、蜡块四周留蜡边太少、石蜡硬度过大，黏度不够。解决方法包括重新磨刀、调整切片刀的角度、重新包埋或将蜡块四周熔化补蜡（组织块周围保留的石蜡以2mm左右为宜）、适当加些蜂蜡或更换熔点较低的石蜡重新包埋。

（二）切片弯曲且不能形成直带

原因有蜡块上下或左右两边不平行、蜡块与切片刀刀口不平行、组织块外形不整齐、切片刀各处的锋利程度不一致。解决办法是将蜡块四边反复修平对称、调节蜡块夹持器使其与切片刀平行、修整组织块时修切整齐、移动切片刀更换刀口位置。

（三）切片上出现裂纹

原因可能是切片刀上有小缺口或刀口不平整、组织中含有较硬物质、包埋时石蜡冻结太慢。解决方法为调换刀口部位或重新磨刀、若组织中硬性物质太多则不宜使用该组织、纠正包埋时的缺点（一般待蜡块周围凝结一层，即可放入冷水中）。

（四）切片粘在切片刀上或蜡块上且不易取下

这种情况通常是由于切片时有静电作用，在冬季或气候干燥时容易出现。解决方法是使用加湿器增加空气中的水分，减少静电作用。

（五）切片厚薄不均

原因可能是切片微动部分失灵、齿轮跳格，或者蜡块太大、过硬，转动时刀刃受震动。解决办法是修理切片机失灵的部分，调整螺旋，加机油润滑零件，必要时请专业技术人员调整切片机；如蜡块过大，以后取材时注意取材大小，蜡块组织过硬，可返回水中浸泡，再重新脱水和包埋。

（六）切片碎烂或组织脱出并与石蜡分离

原因包括组织脱水、透明不够，浸蜡时间过长、浸蜡温度过高，组织中含有乙醇等导致石蜡不易渗入组织，二甲苯使用时间过久。解决方法是按组织大小厚薄选择脱水、透明时间，依组织的性质和结构特点确定浸蜡时间，控制包埋温度；若脱水、透明渗蜡不够，应重新熔化，退回入二甲苯和酒精，再进行渗蜡包埋；更换二甲苯。

（七）切片皱褶太多且不能完全展开

原因可能是石蜡太软或室温过高、切片刀上粘有残余的石蜡、组织浸蜡时间不够或脱水、透明不够、切片刀不锋利。解决方法是将蜡块放入冰箱中冰冻后切片，并在切片时一边切片一边用冰块冰冻或换蜡，如室温过高可开空调降低室温；用棉花沾少许二甲苯将刀口拭干净；重复浸蜡过程；将切片刀磨锐利再行切片。

总之，要快速上手石蜡切片技术，需要熟悉各个步骤的操作要点，掌握常见问题的解决方法，并通过不断实践来提高切片质量。