冰冻切片技术的全面解析

一、冰冻切片的发展历程与定义

冰冻切片技术拥有悠久的历史，1818 年皮尔特·德·里默首创了这一技术，1905 年路易斯·威尔逊在梅奥诊所成功完成了第一例冰冻切片诊断，至今已有 100 多年。它是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。具体来说，是在 -15℃至 -23℃的低温环境下，通过快速冷冻让组织硬化，进而切割为 5 - 20μm 的薄片。其核心是利用冰作为支撑介质，替代石蜡切片中的包埋步骤，能够在 15 - 30 分钟内完成制片与诊断，满足术中快速决策的需求。

二、冰冻切片的应用场景

手术中的快速诊断

当医生在手术中切除疑似肿瘤的组织时，需要立即判断其性质，以决定后续手术范围，此时冰冻切片技术就能发挥关键作用。比如在乳腺肿块切除手术中，如果冰冻报告显示是良性的纤维腺瘤，手术可以宣告结束；若报告为乳腺癌，则需要进一步扩大手术范围，切除整个乳房及腋窝淋巴结。肢体的恶性肿瘤如骨肉瘤，通常也需要依据冰冻切片结果决定是否截肢。

了解淋巴结转移情况

可以确定淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，以及转移的程度，从而有利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者采取其他治疗措施。

确定手术范围

对于已确定为恶性肿瘤的患者，能够了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤组织。

其他应用

还可用于显示组织中的脂肪和脂类物质，常见于脂肪瘤及肉瘤等病例；某些酶的显示，如 ATP 酶、琥珀酸脱氢酶等；神经病理学技术中的某些染色法；对某些物质所进行的免疫荧光的研究等。

三、冰冻切片的制作方法

低温恒冷箱冷冻切片制作法

以 Shandon As 620 E 型恒温箱冷冻切片机为例，其箱面上有电子控制板，具备即时冷冻键、除霜键、照明键、消毒键和密锁键等。冷冻箱内左边的冷冻台温度可达 -60℃左右，中间为切片机，工作间温度在 0 - 30℃间可任意调节，并在箱面荧屏显示。操作步骤如下：

1. 取材：未能固定的组织取材不能太大太厚，最好为 24×24×2mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。
2. 包埋与冰冻：取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻。小组织应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻形成小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
3. 修平组织：将冷冻好的组织块夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
4. 调节切片厚度：根据不同的组织而定，原则上细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍厚切，一般在 5 - 10μm 间。
5. 调节防卷板：这是制作冰冻切片的关键，需细心准确地调节，使切片能顺利通过刀与防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上，然后掀起防卷板，取载玻片附贴切片。
6. 选择合适冷冻度：要根据不同的组织选择不同的冷冻度，如切未经固定的脑组织、肝组织和淋巴结时，冷冻箱温度在 -10 - -15℃左右；切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在 -15 - -20℃左右；切带脂肪的组织时，应调至 -25℃左右；切含大量脂肪时，应调至 -30℃。

冰冻切片的快速染色法

切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定 1 分钟后即可染色。具体步骤为切片固定 30 秒 - 1 分钟，水洗，染苏木素 3 - 5 分钟，分化，于碱水中返蓝 20 秒，伊红染色 10 - 20 秒，脱水、透明，中性树胶封固。整个快速制片过程可在 10 分钟内完成，结果与石蜡切片不相上下。

四、冰冻切片的优缺点

优点

1. 简便：不需要对组织进行固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了中间环节。
2. 快速：用时短，能在短时间内完成制片与诊断，满足手术中快速决策的需求。
3. 组织变化小：能较好地保持组织的原有形态。
4. 保存特殊成分：能很好保存脂肪、类脂等成分。
5. 保存抗原活性：能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。

缺点

1. 连续切片困难：不容易做连续切片。
2. 组织大小受限：切取的组织不能过大，否则不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。
3. 薄切片制作难：不容易制作较薄的切片。
4. 冰晶影响：组织块在冻结过程中容易产生水的结晶，影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。

五、冰冻切片的注意事项

新鲜组织的制备

组织应尽可能新鲜，骤冷愈快愈好，以避免冰晶产生。常用的骤冷剂有 CO₂气（ -78℃）、丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（ -80℃）、液氮（ -190℃）、液氮冷却的丙烷（ -19℃）等。液氮适用于组织化学，较安全，但组织块易发生龟裂。

固定组织的制备

为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用 4℃、24 小时的甲醛固定能很好地保存酶类，但对许多脱氢酶和转移酶能灭活，故不宜使用。低温、冷甲醛短时间固定（10 分钟左右）可显示琥珀酸脱氢酶。电镜出现后，为保存细胞的超微结构，以 4%缓冲戊二醛固定较好，这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。

恒冷箱的温度

一般在冷冻后 10 分钟，到接近冷室温度时再切，一般组织在 -15～ -20℃切片最易成功。每种组织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度，例如肝的刀温度为 -18℃、组织温度为 -10℃、恒冷箱温度为 -5℃；肾的刀温度为 -15℃、组织温度为 -8℃、恒冷箱温度为 -5℃等。固定组织一般高 3 - 5 度。

切片机的使用

抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离，使切片平滑通过，抗卷板略高于刀面的最高点。可凭经验调整刀对组织的角度，一般新刀为 20°。操作程序为先接通电源，调定恒冷箱温度，调整切片刀的角度，调定切片厚度，标本置载台致冷达所需温度后，将其安放在切片机推进器上即可切片。恒冷箱视使用情况每周或每月清洁一次冰霜。新刀切片满意，旧刀用自动磨刀机磨刀较好。

六、冰冻切片技术的发展趋势

与数字化技术结合

传统切片需医生在显微镜下人工观察，受限于视野范围，且难以实现远程会诊和数据共享。而数字化切片技术通过扫描设备将传统切片转化为高分辨率的数字图像，医生可在电脑上放大、缩小、标注图像，甚至通过网络邀请异地专家共同会诊，大幅提高了诊断效率和准确性。

与其他诊断技术跨界融合

将切片技术与免疫组化技术结合，通过特殊抗体标记细胞中的特定抗原，能让原本难以区分的肿瘤细胞更加清晰地显示出来，拓展了冰冻切片技术的应用场景，为精准医疗提供更有力的支持。未来，冰冻切片技术有望在更多领域发挥重要作用，不断推动医学诊断的发展。