固定组织冰冻切片制作

一、固定组织冰冻切片概述

固定组织冰冻切片，又称冷冻切片，是一种通过快速冷冻组织样本并在低温条件下切片的技术。与传统的石蜡切片需要数天不同，冰冻切片能在10 - 20分钟内完成制片，适用于术中快速病理诊断。其原理是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片，在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。

二、制作所需材料与仪器

材料

新鲜组织是制作固定组织冰冻切片的基础，要尽可能选取新鲜、具有代表性的组织。此外，还需要H2O2、酒精、丙酮、PBS、DAPI工作液、中性树胶等试剂。其中，酒精和丙酮常用于固定切片，PBS用于清洗切片，DAPI工作液用于染核，中性树胶则用于封片。OCT包埋剂也是必不可少的材料，它能为组织提供支撑，便于切片操作。

仪器

主要仪器包括速冻架、恒冷箱切片机、烘箱、荧光显微镜等。速冻架用于速冻组织，恒冷箱切片机是进行切片操作的核心设备，能在低温环境下将组织切成薄片。烘箱用于干燥切片，荧光显微镜则用于观察切片的染色效果。

三、组织取材要点

取材的及时性

取材时应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。因为组织在离体后，细胞会逐渐死亡，其形态和抗原性也会发生改变，从而影响切片的质量和诊断结果。所以，一旦获取组织，应立即进行后续处理。

取材的部位选择

外科医生将新鲜组织送至病理科后，病理技师要选取最具代表性的部位，如肿瘤边缘或可疑病变区，同时要避免坏死或出血区域。选取的组织大小一般不超过1.5×1.5×0.3cm，这样的大小既便于后续的冷冻和切片操作，又能保证包含足够的病变信息。

四、组织冷冻方法

直接冷冻法

对于小样本，可直接放入恒冷切片机的冷冻台进行冷冻。这种方法操作简单，但要求样本体积较小，否则可能会导致冷冻不均匀。

OCT包埋法

较大或易碎的组织需用OCT（Optimal Cutting Temperature）胶包埋，以提供支撑。具体操作是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内，如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10 - 20 s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机进行冰冻切片。若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入 - 80℃冰箱贮存备用。

液氮速冻法

某些特殊研究，如酶活性检测，需用液氮（ - 196℃）急速冷冻，以减少冰晶损伤。但这种方法对操作要求较高，需要严格控制冷冻时间和温度，以确保组织的结构和活性不受影响。

五、切片操作流程

切片机的选择与设置

恒温冰冻切片机是较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5 - 10um。切片时，低温室内温度以 - 15℃ - - 20℃为宜，温度过低组织易破碎。抗卷板的位置及角度要适当，以保证切片顺利、完整，无褶皱和破碎。

切片厚度的调整

根据组织类型和诊断需求调整切片厚度，一般为4 - 8μm。过厚或过薄都可能影响诊断，例如过厚的切片可能会导致细胞重叠，影响观察效果；过薄的切片则可能会使组织破碎，无法完整呈现组织结构。

切片的贴片与处理

将切下的薄片迅速贴附于载玻片上，切好后室温放置30 min，然后入4℃丙酮固定5 - 10 min，再放入烘箱干燥20 min，之后用PBS洗5 min×3次。还可进行抗原热修复，如微波热修复，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5 - 10 min，消除内源性过氧化物酶的活性。

六、固定与染色及封片步骤

固定

切片完成后应迅速固定，以免组织自溶或抗原丢失。常见的固定液有甲醇或乙醇。固定时，将切片立即放入固定液中，确保组织完全浸没。

染色

通常采用HE（苏木精 - 伊红）染色法，苏木精染细胞核（蓝色），伊红染细胞质（粉红色），使细胞核和细胞质清晰可见，便于病理医生观察。染色时间和条件应严格控制，以保证染色效果。例如，苏木精染色时间过长可能会导致细胞核颜色过深，影响观察；染色时间过短则可能使细胞核染色不明显。

封片

滴加树脂封固剂，盖上盖玻片。封片后，切片就可以由病理医生在显微镜下进行诊断。在封片过程中，要注意避免产生气泡，以免影响观察效果。

固定组织冰冻切片制作是一项技术要求较高的工作，需要从取材、冷冻、切片、固定、染色到封片等各个环节都认真操作，才能制作出高质量的切片，为疾病的诊断和治疗提供有力的支持。