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冰冻切片载玻片的处理

2026-04-14 09:40

冰冻切片载玻片的处理

一、载玻片处理的重要性

冰冻切片技术在生物学、医学等领域具有广泛应用，如在肿瘤性质判断、确定手术范围、判断淋巴结转移以及手术切缘判定等方面发挥着重要作用。而载玻片的处理对于冰冻切片的质量和后续实验结果至关重要。其主要目的是让组织切片、细胞牢固贴附在玻片上，防止在烤片、脱蜡、水化、抗原修复、染色等过程中出现脱片、卷片、掉片等问题，从而保证实验的顺利进行和结果的准确性。如果载玻片处理不当，可能导致切片脱落，影响后续的观察和分析，使实验数据不准确，甚至可能需要重新进行切片操作，浪费时间和资源。

二、常用的载玻片处理方法

多聚赖氨酸（PLL）处理法

多聚赖氨酸是最常用、最通用的粘附剂。首先要进行玻片预处理，这是必须的步骤。将玻片用洗洁精刷洗，然后用自来水冲净，再用蒸馏水冲净，之后进行烘干或晾干。接着将玻片浸泡在无水乙醇中30分钟，晾干，确保玻片无油、无尘、无杂质。之后进行多聚赖氨酸包被，把干净玻片完全浸泡在0.01%或0.1%的PLL工作液中10分钟，缓慢取出并垂直沥干，室温晾干2小时以上或37℃烘干，最后4℃密封保存，需在1个月内使用。

明胶 + 铬明矾处理法

这是一种经济、传统的方法。制作时，将1g明胶、0.1g铬明矾加入200ml蒸馏水中，在40℃加热溶解。然后将玻片浸入该溶液5分钟，取出晾干即可。这种方法成本较低，适合一些对成本控制有要求的实验。

APES（氨丙基三乙氧基硅烷）处理法

该方法粘附力强，适合难贴组织。先将玻片洗净晾干，然后浸入1:50丙酮稀释的APES液20 - 30秒，取出停10秒，接着用丙酮洗1次，再用蒸馏水洗2次，最后烘干备用。其特点是结合牢固，耐抗原修复（高温高压）。

商品化防脱玻片

这种玻片可以直接使用，无需进行额外的处理，为实验操作提供了便利。但在选择商品化防脱玻片时，要注意其质量和适用性，确保能够满足实验需求。

三、处理步骤详解

玻片预处理

玻片预处理是处理载玻片的基础步骤。使用洗洁精刷洗玻片，可以有效去除玻片表面的油污和杂质。自来水冲净后再用蒸馏水冲净，能进一步保证玻片的清洁度。烘干或晾干后浸泡无水乙醇30分钟，这一步可以起到消毒和去除残留杂质的作用，晾干后的玻片应保证无油、无尘、无杂质，为后续的粘附剂包被做好准备。

粘附剂包被

不同的粘附剂包被方法有所不同。以多聚赖氨酸为例，将其配制成合适浓度的工作液，把玻片完全浸泡其中10分钟，使玻片表面充分接触粘附剂。缓慢取出并垂直沥干，这样可以使粘附剂均匀分布在玻片表面。室温晾干2小时以上或37℃烘干，能让粘附剂更好地附着在玻片上。对于APES处理法，要严格控制浸入稀释液的时间和后续的清洗步骤，以确保粘附效果。明胶 + 铬明矾处理法则要注意溶液的配制温度和玻片浸泡时间。

干燥与保存

处理后的玻片需要进行干燥处理。室温晾干或37℃烘干都是可行的方法。干燥后的玻片要进行密封保存，一般4℃密封保存，并且要在1个月内使用，以保证粘附剂的活性和玻片的质量。同时，保存过程中要注意防尘、防潮，避免玻片受到污染。

四、处理后载玻片的使用要点

贴片操作

处理后的载玻片在贴片时，要注意保持载玻片与刀面的角度成30° - 45°，这样有利于切片的附贴。用于黏附组织片的载玻片应放在常温的地方，不可放在冷冻室中，以保持冰冻组织片与载玻片有一定的温差，利于切片的附贴，防止脱片。此外，载玻片要干净，可在95%的乙醇内浸泡2小时，再用蒸馏水反复冲洗，浸泡后的载玻片须先用清洁纱布把片子擦拭干净，贮于干净的盒子中。

烤片操作

贴片后需要进行烤片操作，一般有两种方式。一种是37℃烤片4 - 12小时，另一种是60℃烤片30分钟。烤片的目的是使组织切片更好地贴附在载玻片上，不同的烤片方式可以根据实验的具体要求和组织切片的特点进行选择。

抗原修复

如果需要进行高温抗原修复，建议使用APES或PLL双处理的载玻片，这样可以保证在高温高压的抗原修复过程中，切片依然能够牢固地贴附在载玻片上，不发生脱落现象。

五、载玻片处理对冰冻切片质量的影响

切片的完整性

合适的载玻片处理方法可以保证切片的完整性。如果载玻片处理不当，切片可能会出现皱缩、卷缩或脱落等问题。例如，刀片不够锋利、防卷板中有异物、防卷板与刀片位置不协调，以及包埋剂未完全包埋等因素，可能导致切片出现皱缩或卷缩；而样本中存在坏死区域、切片过厚、载玻片上有异物等原因，则可能引起切片脱落或吸附性差。通过正确处理载玻片，可以减少这些问题的发生，使切片能够完整地贴附在载玻片上，便于后续的观察和分析。

抗原活性

载玻片处理对组织内抗原活性也有一定影响。与石蜡切片相比，冰冻切片能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原。而合适的载玻片处理可以更好地保持这种抗原活性。例如，使用多聚赖氨酸处理的载玻片，其强阳离子特性有助于防止玻片掉片，同时也能在一定程度上保护组织内的抗原活性，保证后续免疫荧光等实验的准确性。

染色效果

载玻片处理的好坏会直接影响染色效果。如果切片在染色过程中出现脱片、卷片等问题，会导致染色不均匀，影响观察和分析结果。而经过良好处理的载玻片，能够使切片牢固贴附，染色剂能够均匀地作用于切片，从而获得清晰、准确的染色效果，为后续的诊断和研究提供可靠的依据。

六、常见问题及解决对策

切片皱缩或卷缩

切片出现皱缩或卷缩可能是由于刀片不够锋利、防卷板中有异物、防卷板与刀片位置不协调，以及包埋剂未完全包埋等原因引起的。解决方法包括及时更换锋利的刀片，清理防卷板中的异物，调整防卷板与刀片的位置，确保包埋剂完全包埋组织。如果切片过程中组织发脆，一般是组织冷冻过度，可将冰冻组织连同支撑器取出来在室温中停留片刻再进行切片，也可调高冰冻点。

切片脱落或吸附性差

切片脱落或具有较差的吸附性可能由在实验前未将防脱载玻片置于冷冻切片机内、样本中存在坏死区域、切片过厚、载玻片上有异物等原因引起。为防止这些问题，需要在实验前将防脱载玻片提前放入冷冻切片机内，选择质量好的样本，控制切片厚度，保证载玻片干净。在贴片时，要注意载玻片与刀面的角度和温差，以提高切片的吸附性。